El desnivel acumulado es la métrica que define verdaderamente la dificultad de una carrera de trail running. Dos pruebas de 100 kilómetros pueden tener duraciones medias completamente distintas si una tiene 3.000 metros de desnivel positivo y la otra tiene 8.000. El corredor de trail aprende desde el principio a leer tanto la distancia como el perfil altimétrico para hacerse una idea realista del esfuerzo que le espera en cada prueba.
El desnivel positivo acumulado (D+) es la cifra que más se menciona en la descripción de las carreras porque mide el trabajo gravitacional total que el corredor debe superar. Cada metro de subida exige una contracción muscular activa del sistema cardiovascular y del tren inferior, especialmente de glúteos, cuádriceps y pantorrillas. El desnivel negativo (D-) es menos mencionado pero igualmente importante: las bajadas prolongadas generan un daño muscular excéntrico en los cuádriceps que puede ser limitante en las últimas horas de un ultra.
La relación entre distancia y desnivel ha llevado a la industria del trail running a desarrollar fórmulas de equivalencia que permiten comparar la dificultad de distintas pruebas. La más conocida calcula un «kilómetro esfuerzo» que equivale a 1 km llano o a 100 metros de desnivel positivo, aunque existen variantes con diferentes coeficientes. La ITRA utiliza su propio sistema para clasificar las carreras por nivel de dificultad, y el desnivel es siempre uno de los factores determinantes de esa clasificación.